保存條件 

      常溫10~25℃保存 12 個(gè)月蛋白酶 K -20℃保存。 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介 

      本試劑盒可從≤20 mg 動(dòng)物軟組織(肝臟、脾臟、腎臟腦等) 、≤1×107 個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞中快速提取 總 RNA。試劑盒基于硅膠柱純化技術(shù)提取過(guò)程中無(wú)需使用 DTT 及 β-巰基乙醇整個(gè)提取過(guò)程可在 30 min 內(nèi)完成。試劑盒結(jié)合 DNA 過(guò)濾技術(shù)可高效地過(guò)濾去除基因組 DNA提取的總 RNA 純度 高無(wú)蛋白和其它雜質(zhì)的污染可用于 RT-PCR、Northern Blot、Poly A 純化、RNase 保護(hù)分析和 體外翻譯等實(shí)驗(yàn)。

產(chǎn)品特點(diǎn) 

操作簡(jiǎn)便30 min 內(nèi)完成數(shù)個(gè)樣品的總 RNA 提取 

高效去除基因組 DNA獨(dú)特的基因組 DNA 過(guò)濾柱無(wú)需 DNase 處理 

安全低毒無(wú)需 DTT 及β-巰基乙醇等有毒試劑 

RNA 純度高提取的 RNA 無(wú)雜質(zhì)殘留適用于對(duì)純度、完整性要求很高的下游實(shí)驗(yàn)。

適用范圍 

       本品適用于動(dòng)物軟組織、細(xì)胞等樣品的總 RNA 提取。

注意事項(xiàng) 

   1. 第一次使用前應(yīng)在漂洗液 Buffer FRW1 中加入 48 mL 的無(wú)水乙醇

   2. 使用無(wú) RNase 的塑料制品和槍頭避免交叉污染經(jīng)常更換新手套。因?yàn)槠つw經(jīng)常帶有細(xì)菌、汗 液及 RNase 等可能導(dǎo)致 RNA 降解 

   3. RNA 在裂解液 FRL 中時(shí)不會(huì)被 RNase 降解。但提取后繼續(xù)處理過(guò)程中應(yīng)使用不含 RNase 的塑 料和玻璃器皿。玻璃器皿可在 150℃烘烤 4 h塑料器皿可在 0.5 M NaOH 中浸泡 10 min然 后用水徹底清洗、滅菌 

   4. 配制溶液如 70%乙醇應(yīng)使用 RNase-Free ddH2O將水加入干凈的玻璃瓶中加 DEPC 至終濃 度為 0.1%(V/V)混勻放置過(guò)夜后高壓滅菌。 

使用方法 

一、從動(dòng)物組織中提取總 RNA 

   1. 每 10~20 mg 組織加 350 μL Buffer FRL用電動(dòng)勻漿器將組織徹底勻漿, 然后加入 10 μL  Proteinase K混勻后室溫放置 5 min 

注意脾臟組織建議使用 5 mg肌肉類的組織可以增加到 50~100 mg。 

   2. 12,000 rpm (~13,400×g) 離心 2~5 min取上清按第 3 步進(jìn)行操作 

二、從培養(yǎng)細(xì)胞中提取總 RNA 

       本產(chǎn)品單次可處理 102~107 個(gè)細(xì)胞。初次使用時(shí)建議使用 2~5×106 個(gè)細(xì)胞。根據(jù)結(jié)果再調(diào)整 細(xì)胞量。但不論何種情況細(xì)胞量不要超過(guò) 1×107。 

   1. 加入適量的 Buffer FRL 至細(xì)胞樣品中打散細(xì)胞 

   1) 懸浮細(xì)胞離心收集的細(xì)胞彈打或渦旋松散細(xì)胞沉淀加入適量 Buffer FRL 和 10 μL Proteinase K渦旋或用移液槍吸打打散細(xì)胞。

   2) 貼壁細(xì)胞可直接在培養(yǎng)容器中裂解容器直徑不超過(guò) 10 cm或者使用胰蛋白酶處理后離心 收集細(xì)胞沉淀。

    a. 直接裂解法徹底吸棄培養(yǎng)液向培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中加入適量的 Buffer FRL 和 10  μL Proteinase K。

    b. 胰蛋白酶處理法徹底吸棄培養(yǎng)液用 PBS 洗滌細(xì)胞吸除 PBS加入含有 0.10%~0.25% 胰 蛋白酶的 PBS 處理細(xì)胞當(dāng)細(xì)胞脫離容器壁時(shí)加入含有血清的培養(yǎng)基失活胰蛋白酶將細(xì)胞溶 液轉(zhuǎn)移至 RNase-Free 的離心管中300×g 離心 5 min收集細(xì)胞沉淀仔細(xì)吸除所有上清加 入適量的 Buffer FRL 和 10 μL Proteinase K。

   2. 12,000 rpm (~13,400×g) 離心 2~5 min取上清按第 3 步進(jìn)行操作 

注意樣品量過(guò)多裂解不充分會(huì)導(dǎo)致裂解液粘稠堵塞 gDNA 過(guò)濾柱如果裂解液非常粘稠可適當(dāng)增加 裂解液用量。

   3. 把 RNase-Free gDNA Remove Column 放在 2 mL 收集管中把細(xì)胞裂解液或組織上清液轉(zhuǎn) 移至 gDNA 過(guò)濾柱中12,000 rpm (~13,400×g) 離心 30 s保留濾液

注意組織裂解液需高速離心去除雜質(zhì)細(xì)胞碎片會(huì)引起柱子的堵塞。處理某些樣品時(shí)離心后裂解液表 面還可能會(huì)有一層脂類層轉(zhuǎn)移上清液盡量不要吸到這些物質(zhì)。若 gDNA 過(guò)濾柱堵塞可將濾液吸出加 入適量裂解液勻漿后再轉(zhuǎn)移至新的 gDNA 過(guò)濾柱中。

   4. 丟棄 gDNA 過(guò)濾柱濾液中加入等倍體積 70%乙醇用移液槍吸打 3~5 次 

   5. 把 RNase-FreeRNA Column 放在 2 mL 收集管中將溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)移至吸附柱中。 12,000 rpm (~13,400×g) 離心 30 s倒掉收集管中的廢液把吸附柱放回收集管中 

   6. 如不進(jìn)行 DNase I 消化加入 700 μL Buffer FRW 至吸附柱上12,000 rpm (~13,400×g) 離 心 30 s倒掉收集管中的廢液把吸附柱放回收集管中 

   7. 可選若后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì) RNA 純度比較嚴(yán)格可選擇使用 DNase I需另外訂購(gòu)進(jìn)行膜上 DNase 消化 

    1) 向 RNase-Free 吸附柱中加入 350 μL Buffer FRW12,000 rpm (~13,400×g)離心 30 s棄廢 液將吸附柱放回收集管中

    2) 向吸附柱中央加入 DNase I 工作液室溫放置 15 min 

    3) 向 RNase-Free 吸附柱中加入 350 μL Buffer FRW12,000 rpm (~13,400×g)離心 30 s棄廢 液將吸附柱放回收集管中 

    8. 加入 500 μL Buffer FRW1使用前請(qǐng)先檢查是否加入乙醇至吸附柱中室溫靜置 2 min12,000  rpm (~13,400×g) 離心 30 s倒掉廢液把吸附柱放回收集管中 

    9. 重復(fù)步驟 8 

  10. 12,000 rpm (~13,400×g) 離心 2 min倒掉廢液將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘以徹底晾干 吸附材料中殘留的漂洗液 

注意此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除漂洗液的殘留可能會(huì)影響后續(xù)的 RT 等實(shí)驗(yàn)。 

  11. 將吸附柱轉(zhuǎn)移至新的 RNase-Free 離心管中向吸附膜的中間部位懸空滴加 30~100 μL RNaseFree ddH2O室溫靜置 2 min12,000 rpm (~13,400×g) 離心 2 min得到 RNA 溶液將洗 脫的 RNA 溶液置于-80℃保存。

注意洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于 30 μL體積過(guò)小影響回收效率。 

常見問(wèn)題與解決辦法 

 Q1柱子出現(xiàn)堵塞 

 A1

     1) 樣品過(guò)量。裂解液粘稠減少樣品量或加大裂解液用量樣品量過(guò)多反而會(huì)降低產(chǎn)量和純度 

     2) 裂解液離心不充分。組織裂解液需高速離心去除雜質(zhì)雜質(zhì)會(huì)引起柱子的堵塞轉(zhuǎn)移上清液盡量 不要吸到雜質(zhì) 

     3) 離心溫度過(guò)低。本產(chǎn)品使用操作均在室溫下進(jìn)行。

 Q2RNA 提取過(guò)程中 gDNA 過(guò)濾柱堵塞

 A2 

     1) 增加離心次數(shù)、時(shí)間或轉(zhuǎn)數(shù) 

     2) 可將濾液吸出加入適量裂解液勻漿后再轉(zhuǎn)移至新的 gDNA 過(guò)濾柱中。