為什么要使用酵母表達(dá)系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)互作研究?

酵母可以提供一個(gè)體內(nèi)真核系統(tǒng)，同時(shí)又兼具原核細(xì)菌系統(tǒng)的可操作性強(qiáng)、簡(jiǎn)單易用的優(yōu)點(diǎn)。在酵母體內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)可以正確的折疊；提供中性pH內(nèi)部環(huán)境；可以形成二硫鍵和其他真核系統(tǒng)共有的翻譯后修飾。這些特點(diǎn)對(duì)于維持天然蛋白結(jié)構(gòu)獲得真實(shí)的蛋白質(zhì)互作關(guān)系至關(guān)重要。同時(shí)，酵母可操作性強(qiáng)，并且已進(jìn)行全基因組測(cè)序。利用同源重組可以很方便地直接在酵母中構(gòu)建文庫(kù)。

用于酵母雙雜交篩選的bait蛋白質(zhì)有什么要求?

Bait蛋白質(zhì)應(yīng)該是核蛋白質(zhì)或胞漿蛋白質(zhì)；分泌型蛋白質(zhì)不能用作bait;通常來(lái)講，bait不能帶有跨膜結(jié)構(gòu)域；bait和prey的互作不能依賴于糖基化，這是由于酵母翻譯后修飾不包括糖基化；bait與GAL4 BD域融合表達(dá)后可以正確的折疊；bait不能激活酵母中轉(zhuǎn)錄報(bào)告基因的表達(dá)(即不能有自激活活性)。

以經(jīng)驗(yàn)來(lái)看，bait不宜過(guò)大，過(guò)大的外源性融合蛋白在酵母中不穩(wěn)定，我們推薦bait不超過(guò)100 kD,或bait載體的DNA插入片段不超過(guò)3kb。大多數(shù)情況下，bait的設(shè)計(jì)依賴于經(jīng)驗(yàn)，很難確定bait的效果會(huì)如何。酵母雜交中插入片段的N端與147個(gè)氨基酸的GAL4 BD融合表達(dá)，這可能會(huì)影響蛋白折疊，以及插入的結(jié)構(gòu)域能否進(jìn)行蛋白質(zhì)互作。比較大的bait可能會(huì)引起非特異性互作而提高背景，推薦使用較小的、特異的bait進(jìn)行酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。小至8個(gè)氨基酸，大至750個(gè)氨基酸的蛋白都已經(jīng)被成功用于酵母雙雜交研究。

做酵母mating實(shí)驗(yàn)的最佳時(shí)間是多久?需要注意什么?

酵母mating實(shí)驗(yàn)一般需要20-24小時(shí)。我們推薦通過(guò)檢測(cè)到顯微鏡下的三葉草結(jié)構(gòu)作為酵母接合反應(yīng)成功的根據(jù)，一般的酵母接合效率為2-5%左右。當(dāng)對(duì)誘餌菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)過(guò)夜時(shí)，應(yīng)挑選大的、新鮮的克隆進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)離心和重懸后，再使用血球計(jì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，提高雜交效率。進(jìn)行mating實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要低速搖菌30-50 rpm條件下培養(yǎng)，20 h后顯微鏡下觀察是否有接合反應(yīng)發(fā)生，若沒(méi)有繼續(xù)培養(yǎng)4 h。

酵母雙雜交可以用兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化一個(gè)菌株進(jìn)行蛋白相互作用的篩選嗎，與接合反應(yīng)相比較哪個(gè)效果好?

可以將兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化Y2H Gold菌株進(jìn)行蛋白相互作用的篩選，但這種方式的實(shí)驗(yàn)操作轉(zhuǎn)化效率不好控制，穩(wěn)定性不好。利用酵母菌有性生殖的過(guò)程，采用兩種不同類(lèi)型的菌株(Y187和Y2H Gold),通過(guò)它們之間的有性接合反應(yīng)進(jìn)行篩選，篩選方式很科學(xué)，假陽(yáng)性率低。

使用Matchmaker系統(tǒng)做酵母雙雜交，轉(zhuǎn)化效率很低(沒(méi)有做對(duì)照實(shí)驗(yàn)),這是什么原因?

建議先做對(duì)照實(shí)驗(yàn)；DNA質(zhì)量一定要高，可以用乙醇再次純化；DMSO和Carrier DNA質(zhì)量要高，最好是新鮮的，Carrier DNA在轉(zhuǎn)化之前最好用沸水變性；SD培養(yǎng)基pH值應(yīng)調(diào)為5.8,YPDA應(yīng)調(diào)為6.5。重新配制培養(yǎng)基，檢測(cè)對(duì)照的轉(zhuǎn)化效率；可能是BD載體翻譯出來(lái)的融合蛋白質(zhì)對(duì)酵母菌有毒性。

一般來(lái)說(shuō)，保存于25%甘油的酵母菌株在每次解凍后會(huì)丟失10%的活力細(xì)胞。因此，大多數(shù)凍存的酵母在融化溫度不超過(guò)室溫而且操作小心的條件下，最多可容忍10次凍融。有兩個(gè)例外情況請(qǐng)注意：預(yù)制的酵母文庫(kù)和酵母感受態(tài)細(xì)胞。為篩選到基因覆蓋度最廣的文庫(kù)，預(yù)制的酵母文庫(kù)一旦解凍，就必須立即使用且不要重新凍存。同樣，為得到最高轉(zhuǎn)化效率，酵母感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)該立即使用且避免凍存。

什么是均一化處理，為什么要進(jìn)行均一化處理?

均一化文庫(kù)是指某一特定組織或細(xì)胞的所有表達(dá)基因均包含其中，且在cDNA文庫(kù)中表達(dá)基因?qū)?yīng)的cDNA的拷貝數(shù)相等或接近。在均一化cDNA文庫(kù)中，高豐度基因與低豐度基因均衡，這就避免了在篩選的過(guò)程中由于基因組本身基因豐度的高低而影響到篩選概率的問(wèn)題，因此這樣的文庫(kù)具有更高的基因代表性。使用雙鏈特異性核酸酶(Duplex-Specific Nuclease, DSN),降解雜交過(guò)程中形成的雙鏈DNA。高豐度的基因形成雙鏈的速度較快，所以降解也比較多，從而達(dá)到均一化的目的。

不可以，X-Gal與X-Alpha-Gal不同。X-Gal是E.coli β-半乳糖苷酶(LacZ)的反應(yīng)底物，而X-Alpha-Gal是酵母α-半乳糖苷酶(Mel1p)的反應(yīng)底物。X-Alpha-Gal在Matchmaker Gold系統(tǒng)中用作藍(lán)白篩選的篩選底物，在蛋白質(zhì)互作激活mel1基因表達(dá)后，酵母細(xì)胞可以分泌表達(dá)Mel1p。

在兩缺培養(yǎng)基上長(zhǎng)出墨綠色的菌落，是否正常?

正常情況下在添加了X-α-gal的雙缺平板上如果有藍(lán)色的菌落長(zhǎng)出，說(shuō)明研究的兩個(gè)蛋白間有陽(yáng)性的相互作用，如果菌落是白色的說(shuō)明研究的兩個(gè)蛋白沒(méi)有相互作用。出現(xiàn)墨綠色的菌落是一種比較少見(jiàn)的現(xiàn)象，也認(rèn)為是有陽(yáng)性作用，出現(xiàn)這種顏色上的差異，可能是受酵母代謝產(chǎn)物的影響。對(duì)于這種情況，建議在雙缺的平板上挑取單菌落，在四缺平板上劃線，通過(guò)多次劃線的方式進(jìn)一步確定蛋白間的陽(yáng)性相互作用。

滅菌時(shí)溫度過(guò)高，培養(yǎng)基碳化會(huì)導(dǎo)致顏色發(fā)黑，需要保證在121℃,15 min高壓條件下滅菌。

為什么酵母菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)有時(shí)會(huì)變成粉紅色或紅色?

ADE2或ADE1菌株在低含量腺嘌呤培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，嘌呤前體積累造成菌株變紅。百瑞極的YPDA培養(yǎng)基采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方，可以在很大程度上避免色素的積累。

固體培養(yǎng)基不凝固，是什么原因造成的?

瓊脂添加量正確的情況下，培養(yǎng)基不凝固可能是由于滅菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)和pH值偏低造成的。部分地區(qū)的水質(zhì)偏酸，這種情況下，建議調(diào)整SD基本培養(yǎng)基的pH值至5.8,YPDA培養(yǎng)基的pH值至6.5,在121℃的條件下，15 min高壓滅菌。

用酵母雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證有明確報(bào)道的有相互作用的蛋白間的作用，結(jié)果出現(xiàn)假陰性，一個(gè)星期之后還是看不到藍(lán)色菌落，原因是什么?

測(cè)不到陽(yáng)性結(jié)果可能存在以下原因：一、研究的存在相互作用的蛋白是跨膜蛋白或分泌到胞外的蛋白，如果存在這種情況，需要將跨膜區(qū)或者信號(hào)肽序列都去除，因?yàn)榻湍鸽p雜交系統(tǒng)驗(yàn)證蛋白相互作用是在核內(nèi)進(jìn)行的；二、雜交的蛋白在宿主細(xì)胞中表達(dá)不穩(wěn)定，GAL4融合區(qū)域堵塞了相互作用的位點(diǎn)，雜交蛋白在酵母體內(nèi)進(jìn)行了不正確的折疊都會(huì)影響到兩個(gè)蛋白相互作用的驗(yàn)證；三、有研究表明，有些存在弱相互作用的蛋白最長(zhǎng)半個(gè)月以后才可以看到陽(yáng)性結(jié)果。建議在進(jìn)行酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)之前對(duì)相關(guān)的蛋白特性進(jìn)行分析，或者重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證。