植物科學(xué)新技術(shù) 植物透明化試劑                                                                     

ClearSee?

ClearSee^? 是一種僅需固定、洗凈、透明化三步簡單操作即可實(shí)現(xiàn)植物組織透明化的試劑。作為植物科學(xué)的研究工具，期待可以闡明細(xì)胞水平的現(xiàn)象和整個個體之間的系統(tǒng)聯(lián)系。

HP數(shù)據(jù)：由名古屋大學(xué)大學(xué)院理學(xué)研究科 栗原大輔特任助教、水多陽子研究員提供

◆操作步驟

使用 ClearSee^? 的透明化方法，只需1）固定、2）洗凈、3）透明化三個步驟。詳細(xì)方法可參考隨產(chǎn)品附贈的使用說明書。

以下，是擬南芥葉和幼株的使用案例。

1.　固定

①　使用4%甲醛溶液固定樣本^*1。

②　將樣本放入干燥機(jī)中，用真空泵減壓，在室溫下靜置30分鐘，并固定。

②　以上操作重復(fù)兩次。

②　為了防止植物樣品在減壓過程中飛出，建議打開管蓋，用封口膜密封，并用針在上面扎孔^*2,3。

2.　洗凈

去除固定液，加入1 mL的1×PBS緩沖液，靜置1分鐘。然后去除1×PBS緩沖液，重新加入1 mL的1×PBS緩沖液，靜置1分鐘。

以上操作重復(fù)兩次。

3.　透明化處理

去除1×PBS緩沖液，添加1.3 mL的ClearSee^?。

打開管蓋后用封口膜密封，并用針在上面扎孔。放入干燥機(jī)中，用真空泵減壓，并在室溫下靜置1小時。

取下封口膜，蓋好管蓋。避光，室溫靜置，透明化^*4。

如有需要可更換新的ClearSee^?。

4.　透明化過程

圖4. ClearSee?中的擬南芥葉和幼株

圖5. 可以觀察到樣本周圍葉綠素（1-2天后）

圖6. 更換新的 ClearSee? 后的樣本

圖7. 透明化的擬南芥葉和動株（3-5天后）

使用ClearSee^? 進(jìn)行透明化需要的物品

注意

※　由于植物活體樣本含有空氣，添加溶液時植物就會漂浮起來。請盡可能地將植物樣本浸入固定液中。

※　請將干燥機(jī)設(shè)定在-90 kPa左右。根據(jù)植物樣本的不同，有時減壓會過強(qiáng)。減壓過強(qiáng)的話，會破壞植物組織和細(xì)胞。開始減壓后，由于會抽出植

※　物樣本中的空氣，會產(chǎn)生氣泡。為了讓氣泡消失，請緩慢調(diào)整減壓的壓強(qiáng)。

※　從減壓狀態(tài)恢復(fù)至大氣壓強(qiáng)時，請緩慢進(jìn)行。如果急速恢復(fù)至大氣壓強(qiáng)的話，會破壞植物組織和細(xì)胞。

※　透明化的時間根據(jù)植物種類和組織而異，請參照以下的時間。

※　根：1~2天、葉和幼株：4~7天、雌蕊：2周、成熟組織：4周。

◆觀察案例

5.　觀察

在載玻片上用凡士林或油脂制作一個圍欄，放入適量 ClearSee^?，用鑷子將樣本移入，蓋好蓋玻片，并用熒光顯微鏡觀察。由于 ClearSee^?干燥后會產(chǎn)生沉淀，所以用凡士林或油脂來防止其干燥。觀察結(jié)束后，可以將植物樣本放回裝有 ClearSee^? 的微管中進(jìn)行保存。

另外，用 ClearSee^? 透明化的樣本亦可用熒光色素進(jìn)行染色。細(xì)胞核染色時，向 ClearSee^? 中添加終濃度為 10 μg/ mL 的雙苯甲酰亞胺 H33258 三鹽酸鹽，雙苯甲亞胺 H33342 或 DAPI，細(xì)胞壁染色時，使用終濃度為 1 mg/mL，靜置１小時后，更換新的 ClearSee^? ，再靜置１小時后，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

圖8. 經(jīng)透明化處理的擬南芥葉在明場中呈透明狀態(tài)，葉綠素的紅色自發(fā)熒光消失。

圖8. 　由于可以對整片葉進(jìn)行觀察，因此也可以觀察到維管束內(nèi)的熒光蛋白。比例尺為 200 μm。

圖9. 使用 ClearSee^? 透明化的完整的雌蕊的熒光觀察。

圖2.　用４個顏色（藍(lán)色，綠色，黃色，紅色）的熒光蛋白標(biāo)記花粉管。

圖2.　根據(jù)參考文獻(xiàn)改編轉(zhuǎn)載。

圖10. 使用 ClearSee^? 處理４天的擬南芥的根。

圖10.　生長素應(yīng)答細(xì)胞的細(xì)胞核用綠色、全身的細(xì)胞核用紫色顯示。

圖10.　根據(jù)參考文獻(xiàn)改編轉(zhuǎn)載。

■其他植物的透明化案例

使用 ClearSee^? 透明化６天后的藍(lán)豬耳、矮牽牛、煙草、番茄、黃瓜、稻葉。

稻葉在透明化時，由于葉子的表面有蠟層，因此很難將溶液滲入組織里，通過在氯仿等有機(jī)溶劑中浸泡 10~30 秒除蠟后，開始固定的步驟。

圖11. 使用 ClearSee^? 透明化的各種植物葉片（６天后）

◆參考文獻(xiàn)

Kurihara, D. et al.: Development, 142, 4168-4179 （2015）.

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